超微量紫外分光光度計的應用

        超微量紫外可見分光光度計是通過檢測物質波長處或某一波長范疇內光的吸收度，對物質進行定量與定量分析的儀器設備，目前已成為現代分子生物學、藥物學、食品科學等領域的常用儀器。常用于核酸，蛋白定量以及細菌生長濃度的定量。  

1、核酸的定量  

  核酸的定量是超微量分光光度計使用頻率的功能。可以定量溶于緩沖液的寡核苷酸，單鏈、雙鏈DNA，以及RNA。核酸的吸收峰的吸收波長260nm。每種核酸的分子構成不一，因此其換算系數不同。定量不同類型的核酸，事先要選擇對應的系數。測試后的吸光值經過上述系數的換算，從而得出相應的樣品濃度。

2、核酸的純度檢測  

  除了核酸濃度，超微量分光光度計同時顯示幾個非常重要的比值表示樣品的純度，如：  

（1）A260/A280的比值，用于評估樣品的純度，因為蛋白的吸收峰是280nm。純凈的樣品，比值大于1.8(DNA)或者2.0(RNA)。如果比值低于1.8或者2.0，表示存在蛋白質或者酚類物質的影響。  

（2）A230表示樣品中存在一些污染物，如碳水化合物，多肽，苯酚等，較純凈的核酸A260/A230的比值大于2.0。   

3、蛋白質直接定量  

  這種方法是在280nm波長，直接測試蛋白。超微量分光光度計可以直接顯示出樣品的濃度，或者是選擇相應的換算方法，將吸光值轉換為樣品濃度。由于緩沖液中存在一些雜質，一般要消除320nm的"背景"信息，設定此功能"開"。與測試核酸類似，要求A280的吸光值大于0.1A，的線性范圍在1.0-1.5之間。蛋白質直接定量方法，適合測試較純凈、成分相對單一的蛋白質。紫外直接定量法相對于比色法來說，速度快，操作簡單;但是容易受到平行物質的干擾，如DNA的干擾;另外敏感度低，要求蛋白的濃度較高。  

4、比色法蛋白質定量（顏色反應）  

  蛋白質比色法測定的基礎是蛋白質構成成分:氨基酸與外加的顯色基團或者染料反應，產生有色物質。有色物質的濃度與蛋白質反應的氨基酸數目直接相關，從而反應蛋白質濃度。  

比色方法一般有BCA，Bradford，Lowry等幾種方法。  

由于各種方法反應的基團以及顯色基團不一，所以同時使用幾種方法對同一樣品得出的樣品濃度無可比性。所以在選擇比色法之前，是參照要測試的樣本的化學構成，尋找化學構成類似的標準蛋白作標準品。  

5、OD600（菌落密度）  

  實驗室確定細菌生長密度和生長期，多根據經驗和目測推斷細菌的生長密度。在遇到要求較高的實驗，需要采用分光光度計準確測定細菌細胞密度。通過檢測600nm處細胞生長培養的吸光度，從而監測微生物或其他細胞培養的生長率。OD600是追蹤液體培養物中微生物生長的標準方法。實驗中偶爾會出現菌液的OD值出現負值，原因是采用了顯色的培養基，即細菌培養一段時間后，與培養基反應，發生變色反應。

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